По статистике двум из трех ЭКО-пациенток не удается забеременеть с первой попытки. Заморозка эмбрионов, ставшая теперь более доступной услугой, позволяет упростить повторный цикл, если в предшествующем было получено больше яйцеклеток, чем необходимо. Их подвергают криоконсервации для последующего использования пациенткой, прошедшей предварительную подготовку. Результативность ЭКО-беременностей при такой стратегии ЭКО-лечения приближается к показателям успеха при “свежем переносе”.
За последнее десятилетие востребованность криоконсервации человеческого генеративного материала значительно возросла. По опубликованным данным количество эмбрионов, замороженных для клинического применения, в 2012 году в Великобритании достигло 840 тыс., в 2015 году — более 600 тыс. в США и свыше 60 тыс. в Канаде.
Эти цифры говорят о том, что в наши дни криоконсервация уже не считается чем-то сверхъестественным. Она становится неотъемлемой частью лечения ЭКО, ведущим трендом ВРТ.
Суть процедуры
Криоконсервация эмбрионов — сохранение их при минусовых температурах, как правило, на стадии развития, соответствующей предимплантационной, то есть от момента оплодотворения до образования бластоцисты.
Принцип криоконсервации основан на сохранении жизнеспособности клеток в состоянии анабиоза путем повышения внутри- и внеклеточной вязкости до уровня, на котором останавливаются все молекулярные диффузии и химические процессы.
Криоконсервация эмбрионов обычно выполняется как компонент экстракорпорального оплодотворения. Заморозке подвергают эмбрионы, оставшиеся после предыдущего цикла. “Оттаявший” генеративный биоматериал не теряет своих первоначальных качеств и в любой момент пригоден к использованию.
Роль криопротекторов
Чтобы предотвратить повреждение замораживаемых клеток, протоколы криоконсервации направлены на обезвоживание внутриклеточного пространства и, как следствие, минимизацию внутриклеточного образования льда при сохранении низких концентраций внутриклеточных солей.
Процесс дегидратации смягчается путем добавления в замораживающую среду криопротекторов. В дикой природе многие биоорганизмы вырабатывают подобные вещества для защиты от разрушительного воздействия экстремально низких температур. Так, собственные криопротекторы (антифризовые белки и соединения) помогают арктическим и антарктическим амфибиям, рыбам и насекомым свести к минимуму повреждения от морозов в холодные зимние периоды.
Криопротекторы при заморозке репродуктивного человеческого биоматериала также выполняют роль антифриза, разрушающего водородные связи в воде. Различают два вида криопротекторных агентов:
К дополнительным эффектам криопротекторов относятся:
Каждый тип клетки имеет конкретную оптимальную скорость охлаждения. Она определяется отношением объема клетки к площади поверхности, а также проницаемостью мембраны для воды и криопротекторов.
Если скорость охлаждения (снижение температуры в течение определенного периода времени) низкая, клетки имеют достаточное время для потери воды и достижения максимальной дегидратации, что приводит к минимальному образованию кристаллов льда. И наоборот, при высокой скорости охлаждения время для перемещения воды из клеток ограничено, и риск образования кристаллов льда возрастает.
Способы заморозки
Все методы криоконсервации можно разделить на две группы:
Хотя первый из них (приведший к живорождению в 1984 году) все еще применяется в клинической практике, в последние годы наметился явный переход ко второму, который начал успешно использоваться с 1990 года и в дальнейшем продемонстрировал значительное улучшение показателей в плане выживаемости и имплантации. Предполагается также, что витрификация снижает риск повреждения ДНК.
Оба криопротокола используют аналогичные химические вещества, но сильно различаются по их концентрации, а также по темпам охлаждения и нагревания.
При медленной заморозке применяют:
При витрификации используют:
При медленной заморозке дегидратация без чрезмерной усадочной деформации достигается воздействием внутриклеточных криопротекторов и ограниченным по времени влиянием внеклеточных гиперосмотических условий.
Принцип витрификации заключается в достижении стеклоподобного состояния клетки без образования вредных кристаллов льда. Возникающая при этом экстремальная дегидратация обусловлена очень недолгим воздействием высоких концентраций криопротекторов в условиях высокой скорости охлаждения.
Для достижения сверхбыстрых скоростей охлаждения открытые носители эмбрионов (например, ЭМ-сетка) были спроектированы так, чтобы обеспечить прямой контакт среды, содержащей эмбрион, с жидким азотом.
Различия и сходства между криопротоколами
| Фактор | Медленное охлаждение | Витрификация |
|---|---|---|
| Криопротектор | ДМСО / этиленгликоль / пропандиол | ДМСО / этиленгликоль |
| Концентрация криопротектора (начальная) | Низкая (1,5 моль / л) | Высокая (2 — 5 моль / л) |
| Период инкубации | Длительный (∼3 — 5 ч) | Короткий (несколько минут) |
| Скорость охлаждения | Низкая от — 0,3 до — 1°C / мин) | Высокая ( — 20 °C / мин) |
| Осмотический стресс | Да | Ограничен |
| Токсический стресс | Да | Да |
| Повреждение, вызванное охлаждением | Да | Ограничено |
| Механическая нагрузка (образование кристаллов льда) | Да | Нет |
| Программируемое охладительное оборудование | Да | Нет |
| Носитель | Ампула / соломинка (“закрытая”) | EM-сетка / устройства криолуп / криотип / криотоп (полузакрытые) / высоконадежная соломинка |
| Прямой контакт с жидким азотом | Нет | Да / нет (в случае высоконадежной соломинки) |
Критерии полноценности размороженных эмбрионов
Удачная подсадка эмбрионов после криоконсервации во многом зависит от их состояния после нагревания и “оттаивания”. Слишком медленное протекание этих процессов может привести к прямому или косвенному повреждению клеток путем образования кристаллов льда.
Следовательно, скорость прогрева должна быть достаточно высокой независимо от способа криоконсервации. Качественными считаются полностью интактные размороженные эмбрионы. Они обладают более перспективным потенциалом развития и имплантации, чем те, которые были повреждены при криоконсервации.
Тем не менее, успешная беременность может наступить и после переноса эмбрионов, имеющих только несколько неповрежденных бластомеров. Это демонстрирует хорошую сохраняемость потенциала эмбрионального развития, несмотря на существенный ущерб от замораживания.
Реальный порог для минимальной доли интактных клеток, приводящий к успешной имплантации, не уточнен. Когда хотя бы половина бластомеров из эмбриона остается неповрежденной после “оттаивания”, она считается жизнеспособной. Помимо выживания, возобновление митоза в течение 24 часов после размораживания также связывают с хорошим потенциалом для имплантации.
Важно также учитывать, что пролонгированная культивация приводит к лучшему отбору эмбрионов и, следовательно, к увеличению шансов имплантации, но в то же время к уменьшению числа эмбрионов, выживающих в пролонгированной культуре in vitro, и в результате к снижению частоты беременности за цикл “оттаивания”.
История метода
В 1973 году появились сенсационные публикации о том, что британским эмбриологам Wilmut и Rowson удалось вывести первого сельскохозяйственного животного (теленка), родившегося после переноса замороженного эмбриона.
Появление криодетей
В 1983 году в Австралии была зарегистрирована первая беременность, наступившая при переносе “оттаянного” криоконсервированного человеческого эмбриона. Это случилось благодаря усилиям мельбурнских эмбриологов Alan Trounson и Linda Mohr. Правда, на десятой неделе произошел самопроизвольный аборт. В следующем году в Нидерландах было зафиксировано первое живорождение после криоконсервации эмбрионов.
Стоит также отметить, что в 1978 году, за 6 лет до этого, индийский врач Subash Mukhopadyay из Калькутты сообщил об успешной криоконсервации 8-клеточного эмбриона, который хранился в замороженном состоянии в течение 53 дней и после “оттаивания” был перенесен в материнский организм. Это привело к успешной беременности и живорождению уже в том же 1978 году.
Появившейся на свет ЭКО-девочке дали имя Дурга в чести индийской богини победы. Она родилась всего на 67 дней позже первого в мире ЭКО-ребенка из Великобритании. Д-р Mukhopadyay подвергался преследованиям со стороны властей, и это не позволило ему поделиться своими достижениями с международным научным сообществом.
Оптимизация технологий
С развитием клинического применения ЭКО в начале 1980-х годов были приложены значительные усилия по совершенствованию способов замораживания эмбрионов человека. В это время появились первые публикации, сообщающие о живорождениях после использования криопротекторов, таких как ДМСО, пропандиол и сахароза. Данные методы оказались более надежными и получили широкое распространение.
В 1949 году английский биолог E. J. C. Polge и его коллеги случайно обнаружили криопротекторный эффект глицерина. Оказалось, что это вещество защищает от образования кристаллов при замораживании посредством клеточной дегидратации. Данное открытие привело в 1953 году к успешной криоконсервации спермы сельскохозяйственных животных, а в 1964 году появились первые криобанки для хранения спермы человека.
Было замечено, что криопротекторы могут быть токсичными для клеток. Поэтому на протяжении многих лет шел неустанный поиск менее опасных и более эффективных протекторов, а также их комбинирование с целью снижения индивидуальной концентрации и токсичности.
Витрификация
Свой вклад в дело “приручения холода” внесли в 1985 году американские биологи W. F. Rall и J. M. Fahy. Им удалось успешно витрифицировать раствор относительно большого объема (0,25 мл), содержащий эмбрионы мыши со смесью ДМСО, ацетамида и полиэтиленгликоля, поместив его в жидкий азот.
Это достижение привело к пониманию того, что сокращение срока нахождения клеток в витрифицированном растворе уменьшает его токсичность. Следующим шагом стала замена ДМСО этиленгликолем и смесями нескольких криопротекторов. К концу 1990-х годов витрификация была применена для человеческих эмбрионов (как на стадии бластоцисты, так и на стадии дробления) с достижением живорождения.
Изобретение криотопа
Впервые появившиеся в Японии уникальные носители замораживаемого биоматериала — криотопы — стали прорывом, который позволил внедрить витрификацию эмбрионов в клиническую практику. Конструкция криотопа — полузакрытой сверхнадежной микросоломинки со специальной защитной средой — позволяет замораживать на сверхскорости минимальные объемы биоматериала, что приводит к высоким показателям выживаемости и живорождения.
Массовое внедрение
С 1984-го по 2008-й год, по разным оценкам, родилось от 350 000 до 500 000 ЭКО-детей, появившихся на свет из эмбрионов, замороженных с контролируемой скоростью, а затем хранящихся в жидком азоте. Кроме того, несколько сотен родов за этот же период состоялись благодаря витрификации ооцитов. В настоящее время темпы рождаемости “криодетей” сохраняются.
Преимущества криотехнологии
Внедрение в медпрактику криоконсервации эмбрионов стало переломным моментом в развитии репродуктивной медицины. Главными достоинствами передовой технологии являются:
Перечисленные “плюсы” существенно повысили результативность лечения бесплодия, максимизировали фертильный потенциал пациентов. Криоконсервация эмбрионов по ОМС 2018 года увеличила шансы бесплодных пар на беременность и избавила их от лишних затрат на повторные попытки ЭКО.
Резюме
Эффективность ЭКО после криоконсервации эмбрионов определяется многими факторами. В их числе критерии отбора подлежащих криохранению эмбрионов, методы замораживания и “оттаивания”, синхронизацией развития эндометрия и эмбриона.
Многое зависит и от состояния здоровья женщины. Однако ее фертильный потенциал уже не столь ограничен репродуктивным возрастом, как прежде. Теперь есть возможность сохранить свой генетический материал в криобанке и воспользоваться им при необходимости, избежав при этом риска многоплодия. Не менее важно и то, что криопроцедура стала доступней для большего числа людей.
